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By DIVULGO|diagnóstico  23 Abril 2023

Sin duda, una parte imprescindible en el diagnóstico de enfermedades de cualquier índole, es lo referente a las distintas técnicas que se usan para llevarlo a cabo. La medicina necesita del apoyo de datos cuantitativos y cualitativos para emitir un diagnóstico, y aquí entran las técnicas de diagnóstico tanto clásicas como modernas. En esta ocasión, tras otros post como la técnica de ELISA o el test de flujo lateral (LFT), os presentamos una introducción a una de las clásicas, la inmunofluorescencia.

¿Qué es una inmunofluorescencia?

Es una potente técnica inmunológica útil para el diagnóstico de ciertos tipos de complejos de autoanticuerpos-antígenos. Se clasifica dentro de las técnicas con anticuerpos marcados (un conjugado) y se basa en la presencia de un fluorocromo unido a un anticuerpo o antígeno que se unirá a su complementario (antígeno o anticuerpo respectivamente) produciendo una señal que emite fluorescencia, y que puede verse o “leerse” a través de un microscopio electrónico.

Originalmente descrita en 1950 por Coons y Kaplan, surgió para detectar autoanticuerpos y anticuerpos frente a antígenos tisulares y celulares. Es posible usarla también en muestras en suspensión, como por ejemplo, para detectar antígenos en células vivas. Permite aislar diversas poblaciones celulares según los antígenos de superficie que presentan, tiñéndolos con distintos anticuerpos marcados con diversas partículas fluorescentes. En la actualidad se usa para determinar la concentración de drogas, hormonas y una gran variedad de proteínas y péptidos, por ejemplo.

¿En qué consiste?

Se necesita un conjugado con un grupo fluorocromo unido, el cual, al incidir la luz a una longitud de onda determinada, se excita y emite luz fluorescente. Este fluoróforo se une a la parte Fc (parte cristalizable) de los anticuerpos, que es la que reconocen células efectoras, proteínas inmunes y otros anticuerpos primariamente.

Originalmente, la fuente de luz tradicional usada con fluoresceína era la lámpara de alta presión de vapor de mercurio, pero surgieron otras alternativas más económicas como la lámpara de yodo-cuarzo, que además proveía luz inmediatamente al encenderse. Estas lámparas funcionan linealmente en el visible (longitud de onda 365 nm y separa fácilmente la luz emitida a 525 nm) pero carecen de un sistema de filtros satisfactorio. La longitud de onda óptima para fluorescencia de excitación es 495 nm, ya que la luz emitida por esta longitud de onda es máximamente absorbida a 525 nm. Actualmente, gracias a los filtros, los sistemas de lecturas se han mejorado, incorporando microscopios automatizados, bandejas robotizadas, video cámaras de alta resolución y software específico para el análisis de imágenes.

El más usado en el isotiocianato de fluoresceína (FTIC) que emite luz verde-amarillenta brillante, mientras que para el rojo se ha usado principalmente, la rodamina. La fluoresceína se eligió por la ausencia virtual de fluorescencia verde en tejidos tisulares de mamíferos. Otros compuestos probados han sido rojo anaranjado y el ácido dimetilamino naftil sulfónico que emite amarillo. La selección del fluorocromo es muy importante. Debe ser estable y poseer un coeficiente de extinción molar y rendimientos cuánticos elevados, así como emitir en longitudes de onda apropiadas para no interferir con las reacciones del antígeno (o ligando) con su anticuerpo. En el caso de la fluoresceína, la longitud de onda (de 520 nm) está muy próxima al máximo de sensibilidad de la retina.

El espécimen debe ser iluminado con la mínima pérdida de energía radiante por la lente. Cuando se irradian los fluorocromos con una longitud de onda apropiada, un electrón de la molécula sufre una transición al estado excitado. A medida que el electrón vuelve a su situación inicial, se libera energía física en forma de fotón de menor energía (mayor longitud de onda) que la luz de excitación. El espectro de fluorescencia muestra una longitud de onda de máxima emisión, característica de un determinado compuesto fluorescente. El FTIC tiene un tiempo de interacción de menos de 1 nanosegundo entre la emisión y la excitación, siendo por tanto muy rápido.

Clasificación y tipos de inmunofluorescencias

  • La clasificación puede atenderse a la forma de realización, siendo clasificados así en directos o indirectos:
  • Inmunofluorescencia directa (DIF): en este caso, el anticuerpo marcado con el fluorocromo se une directamente al antígeno diana. Los portas se incuban con el anticuerpo marcado con la fluoresceína directamente contra el antígeno objetivo. Típicamente se usa un panel de anticuerpos directos de distintos isotipos (IgA, IgG e IgM). La concentración de trabajo de cada anticuerpo debe ser titulada previamente para obtener la mejor razón señal-ruido y tras la incubación, se debe aplicar un paso de lavado. El diagnóstico se basa en el patrón de unión así como el isotipo de anticuerpo detectado. Este método directo es rápido y bastante específico, pero debido a que el número de anticuerpos que puede unirse al objetivo específico es limitado, puede ser menos sensible que otras técnicas microbiológicas.
  • Inmunofluorescencia indirecta (IFI): utiliza dos pasos y puede usarse para analizar constituyentes de los tejidos. En el primer paso el anticuerpo no conjugado se une a la diana, y a continuación un anticuerpo secundario (frente a la región Fc del primario) marcado con el fluoróforo se une al anticuerpo primario. Esta técnica es más complicada y consume más tiempo de la directa (requiere un segundo periodo de incubación), pero es más sensible porque más de un anticuerpo secundario puede unirse al primario, lo que amplifica la señal fluorescente. Los anticuerpos usados deben ser de especies distintas para evitar reacciones cruzadas.

La inmunofluorescencia directa es más simple, rápida y consistente, y debe considerarse siempre que sea posible. Para reducir el background se debe usar la mayor dilución posible del anticuerpo que produzca señales positivas inequívocamente.

Imagen creada con Biorender (sólo para fines educativos)
  • Si se clasifica de acuerdo al tipo, se pueden clasificar en homogéneos o heterogéneos, competitivo o no competitivo, de fase sólida, de ligando o de anticuerpo marcados, entre otros:
  • Inmunofluorescencia heterogénea: incluyen un paso de lavado para separar las sondas fluorescentes unidas de las libres. La mayoría usan un antígeno unido a una fase sólida o un anticuerpo. Puede ser competitivo o no.
  • Inmunofluorescencia homogénea: se hacen muestras homogéneas que no requieren separación de conjugados unidos a los libres y normalmente, no son sensibles a las interferencias de fondo de las muestras. Son rápidos, pero frente a los heterogéneos presentan la desventaja de que son menos sensibles y requieren antígenos o anticuerpos marcados específicos relativamente puros e instrumentación más especial.
  • Método fluoroinmunométrico: el analito reacciona en solución con un exceso de anticuerpo marcado. Los anticuerpos marcados residuales se unen al exceso de antígeno unido a la fase sólida. La matriz de la fase sólida se lava y la intensidad de fluorescencia se relaciona inversamente con la concentración de analito. Se puede adaptar para haptenos y proteínas complejas. En serología se usa para detectar anticuerpos de la Rubeola, Toxoplasma gondii, antígenos víricos y anticuerpos antinucleares. En el caso de test homogéneos se usa para la determinación de proteínas séricas y hormonas, cortisol, inmunoglobulinas, progesterona y tiroxina. En los heterogéneos disminuye significativamente la interferencia de sustancias fluorescentes presentes naturalmente en muestras clínicas.
  • Fluoroinmunoensayo en tiempo real: se necesita instrumentación y sondas fluorescentes especiales que aumenten la sensibilidad del ensayo. Se usan sondas con fluorescencia retardada con un periodo de tiempo de 100 nanosegundos. Se pude medir hCG, IgG, cortisol o insulina entre otros.
  • Ensayo de polarización de la fluorescencia: una lente polarizante o prisma pueden resolver la luz en rayos de un solo plano. Cuando se observa desde un ángulo recto con respecto al haz de excitación de la luz polarizada vertical, los compuestos fluorescentes en solución emiten fluorescencia parcialmente polarizada. Esta luz polarizada se transmite a través de la muestra para excitar la sonda fluorescente independientemente de su unión al anticuerpo. Es útil para detectar antígenos de pequeño tamaño y haptenos.
  • Inmunoensayo de transferencia de fluorescencia de excitación (FETI): se usan dos sondas, la fluoresceína como donador de fluorescencia y la rodamina como aceptor (ambos tienen su pico correspondiente a 525 nm). Cuando el antígeno marcado con FITC se une al anticuerpo marcado con rodamina, se produce un bloqueo de la fluorescencia del FITC, lo que implica la transferencia de energía de una sonda electrónicamente excitada a una sonda aceptora. Sirve para ensayos de antígenos con determinantes antigénicos multivalentes.
  • Inmunoensayo de fluorescencia protegida: el antígeno proteico se marca con fluoresceína y se hace reaccionar con un anticuerpo específico para el antígeno. El anticuerpo específico inhibirá estéricamente la reacción de un segundo anticuerpo específico para la fluoresceína que funciona absorbiendo la fluorescencia de la fluoresceína cuando se une al fluoróforo. Se puede emplear en sistemas homogéneos.

¿Cómo se realiza?

Para asegurar el éxito hay algunos parámetros críticos: fijación, permeabilización y determinación de la especificidad de la unión, son aspectos relevantes. Las dos primeras deberán ser determinadas experimentalmente para cada célula-anticuerpo.

Es importante un paso preliminar de fijación para evitar la autolisis, mitigar la putrefacción y preservar la morfología a la vez que la antigenicidad. Los métodos ideales de fijación deben inmovilizar al antígeno sin alterar la arquitectura celular y permitir a los anticuerpos el máximo acceso a cualquier componente celular diana. No hay un método de fijación universal para cada antígeno, sino que se debe determinar empíricamente. Fijadores químicos incluyen reactivos como el formaldehido o el glutaraldehído, y su mecanismo es la unión a componentes celulares o de tejidos formando una unión metileno intra e intermolecular. Otros fijadores son algunos disolventes orgánicos cuya misión es eliminar lípidos y deshidratar las células, desnaturalizando y precipitando componentes celulares. Los alcoholes funcionan extrayendo lípidos y precipitando proteínas, mientras que los aldehídos son reactivos que generan enlaces y generalmente preservan mejor las estructuras de las membranas. Estos fijadores pueden usarse por separado o combinados entre sí. Hay que tener en cuenta que algunos epítopos se pierden con el formaldehído pero se preservan con alcohol, o viceversa.

A veces, incluso aunque el material esté fijado apropiadamente, el epítopo está enmascarado y no es accesible a la unión con el anticuerpo. Los reactivos de permeabilización son típicamente detergentes que desnaturalizan parcialmente las proteínas fijadas, exponiendo el epítopo. Además de las saponinas, que se pueden introducir en el proceso de teñido, tratamiento tras la fijación con Tritón-X100  o SDS del 0.2 al 0.5% es una opción. Frecuentemente, el tratamiento con estos agentes antes de la incubación con el anticuerpo es suficiente para exponer el epítopo.

Tras la fijación, la restauración de la reactividad del epítopo para el anticuerpo es necesaria. Puede hacerse por dos métodos: restauración del epítopo inducida por proteasa (1) o por calor (2). En (1) se usan habitualmente proteasas como Proteinasa-K, tripsina, pepsina y pronasa. En (2) se usan calor y presión para restaurar la estructura secundaria y terciaria, calentándose el tejido en una solución tampón. Se usan habitualmente glicina para pH ácido, ácido cítrico para pH neutro y Tris o EDTA para pH básico.

Otro factor a determinar empíricamente es cómo realizar el paso de bloqueo previo con el fin de evitar la unión del anticuerpo a otros epítopos de la proteína que no son el que se espera. El agente bloqueante dependerá de la proteína y sus características. Los más comúnmente usados son la albúmina bovina de suero (BSA), leche desnatada en polvo o gelatina.

Se debe lavar entre pasos. El tiempo requerido para ello suele ser corto tras la incubación con el suero, pero se recomienda un lavado de 1 hora tras el teñido con el conjugado. Un medio de lavado PBS pH 7.1 ha demostrado ser un reactivo universal y versátil para este propósito.

Para la lectura al microscopio, debe tratarse con un agente de montaje que permita la lectura. De éste será importante considerar el pH, fuerza iónica, viscosidad y la presencia de agentes bloqueadores de grupos. La emisión fluorescente es mayor en medios alcalinos que ácidos. Se ha recomendado el uso de glicerol tamponado entre pH 8.6  y 9, aunque también el uso de éste en 9 partes y 1 de PBS a pH 7.1-7.4. Otras mezclas recomendadas son alcohol polivinílico (PVA) con glicerol, pero el uso de PVA conlleva horas para su disolución y puede acabar precipitando o enturbiando las soluciones.

Especificidad

La calidad de las observaciones dependerá del análisis cuidadoso de la solución de anticuerpo usada así como del conocimiento morfológico bajo el microscopio.

Es importante determinar qué constituye una unión específica con el anticuerpo. Para determinar esto, portas control incubados con el anticuerpo secundario o el suero preinmune y teñidos deben observarse para determinar que constituye un teñido no específico. Idealmente éste debería ser depreciable ya que el patrón de teñido obtenido con el anticuerpo específico es mucho más brillante y distinto. Por eso, rangos de dilución del anticuerpo primario y secundario deben ser examinados para determinar concentraciones óptimas que minimicen el teñido no específico o maximicen el específico.

Para eliminar la fluoresceína no unida se ha propuesto una diálisis prolongada a 4ºC, el fraccionamiento con columnas de dietilaminoetil (DEAE) celulosa, absorción con carbón activo, o la filtración por gel seguida del fraccionamiento de DEAE celulosa.

Lectura

La fiabilidad de las observaciones depende del cuidado y control con que se lleven a cabo las mismas y la idoneidad de su selección. En ocasiones hay dificultades debido a la interacción entre la molécula fluorescente en la solución con el anticuerpo y los componentes de la sección tisular.

Si el background del teñido con el anticuerpo secundario es muy grande, éstos se deben diluir más o probar otros anticuerpos de distintos hospedadores, así como distintos fluoróforos. PBS/FBS es generalmente una buena opción para bloquear efectivamente los sitios no específicos, pero proteínas comúnmente usadas como la BSA o la gelatina pueden usarse.

Sino se observa teñido específico se puede aumentar la concentración o el tiempo de exposición al anticuerpo primario. Sin embargo, si se observa pero es muy débil, se puede aumentar la concentración del anticuerpo tanto primario como secundario. Se podría mejorar mediante el uso de una técnica de doble sándwich: tras la incubación con el anticuerpo primario y el lavado, se incuba primero con el anticuerpo secundario conjugado a FITC frente al anticuerpo primario y luego con otro anticuerpo secundario conjugado a FITC frente al primer anticuerpo secundario.

El tiempo total del ensayo debe ser de unas pocas horas. Los portas fijados y lavados pueden almacenarse a 4ºC por días antes de su uso. La incubación con el anticuerpo primario puede hacerse toda la noche a 4ºC si fuese necesario, como se hacía originalmente, pero McKinney pudo determinar que una adecuada unión ocurre durante una hora a 25ºC.

Ventajas y desventajas del uso de la inmunofluorescencia 

Es una técnica rápida y específica debido a la fluorescencia producida por cada virus específico en cada espécimen específico. Bajo circunstancias favorables un enzima puede ser precisamente localizada en una secreción granular y unas pocas células bacterianas identificadas en una mezcla grande, por ejemplo.

La inmunofluorescencia permite la posibilidad de hacer ensayos multiplex, ofreciendo alta resolución en estos casos. Múltiples antígenos pueden ser teñidos simultáneamente dado que los fluoróforos son solo sensibles a su longitud de onda correspondiente, lo que ayuda en estudios de localización de antígenos.

El anticuerpo primario deber ser purificado en la medida de lo posible para que reconozca solo a la proteína de interés en ensayos de inmunotransferencia. Aunque la purificación por afinidad suele ser óptima para esto, hay que tener en cuenta que los anticuerpos purificados por afinidad no siempre resultan en anticuerpos que reconocen una sola proteína. Además, no todos los anticuerpos que se pueden usar para detectar proteínas por inmunotransferencia funcionan para detectar en inmunofluorescencia. También, hay anticuerpos que reconocen las proteínas en inmunofluorescencia que no reconocen a las proteínas desnaturalizadas y transferidas a una membrana de nitrocelulosa.

La señal fluorescente depende de la calidad y concentración del anticuerpo, el correcto manejo de la muestra y la correcta detección con anticuerpos secundarios. Demasiadas uniones no específicas debido a un anticuerpo de baja calidad o una alta concentración pueden impedir una localización fiable de los inmunocomplejos. Alternativamente, un anticuerpo diluido puede no proporcionar la adecuada señal. En ocasiones es necesario el uso de anticuerpos monoclonales o mezcla de ellos, para evitar reacciones cruzadas.

Se ha visto experimentalmente también que existe una correlación entre teñido no específico y el ratio fluoresceína-proteína, y que se soluciona con el uso de un conjugado potente inmunológicamente diluido hasta que este fondo sea despreciable.

Solo algunos especímenes son apropiados para su uso en inmunofluorescencia, y la toma de la muestra se convierte así en un factor importante y limitante, ya que dependiendo de la localización o la toma de la misma, habrá mejor o peor material de análisis. Un manejo correcto de los especímenes de la biopsia (guardar en medio de transferencia de Michel o congelar rápidamente) es importante para mantener la localización y antigenicidad de los complejos inmunes, lo que significa que se debe poseer destreza y habilidad, así como experiencia para su uso.

El medio de montaje debe ser adecuado para poder observar las células en detalle, siendo glicerol sencillo de usar y menos peligrosos para la salud.

Es conveniente hacer las determinaciones por duplicado, lo que multiplica el trabajo. Y también el uso de controles del ensayo.

Las incubaciones a 37ºC no producen mejores señales que a temperatura ambiente y de hecho se ha observado que producen un aro seco de suero que aumenta las reacciones cruzadas.

Finalmente, la señal fluorescente se pierde con el tiempo tras exponerse a la luz, por lo que es importante conservar las muestras en la oscuridad hasta su uso, usar solo la luz necesaria en el microscopio y usar un agente anti decoloración en el medio de montaje, como la para-fenilendiamina.

¿Dónde se aplica?

Originalmente se usó para el diagnóstico de la Influenza y posteriormente a otras enfermedades víricas. Es particularmente útil cuando la localización citoplasmática es característica, como los cuerpos de inclusión en la Rabia, o cuando los antígenos son de concentración intranuclear principalmente, como en los cultivos celulares de virus de simios.

Los casos de rabia, sospecha de viruela o rubeola en embarazadas, han sido diagnósticos extendidos realizados por inmunofluorescencia.  Actualmente, sigue siendo la técnica de referencia para gran número de autoanticuerpos, siéndolo para anticuerpos antinucleares (ANA) o anticuerpos citoplasmáticos anti neutrófilos (ANCA). Se puede aplicar en pacientes con SIDA, neumonía, legionelosis, cándida, adenovirus, citomegalovirus, herpes, enfermedad celiaca, alergias alimentarias, etc.

En general es una técnica muy útil y versátil que ofrece gran especificidad y que posee características distintas a otros inmunoensayos marcados como el ELISA, por ejemplo. La posibilidad de ensayos multiplex y de determinación de varios antígenos simultáneamente, ofrece una característica muy interesante en el diagnóstico. Su uso sigue siendo rutinario en el laboratorio, pero ha sido adaptada a las nuevas tecnologías mediante el uso de microscopios modernos y el análisis en pantallas. Es por ello, que aun siendo una técnica clásica, sigue presente en los laboratorios de diagnóstico.

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