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By DIVULGO|diagnóstico  16 Enero 2023

El ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas, o ELISA por sus siglas en inglés (enzyme linked immunosorbent assay), es una técnica comúnmente usada en los laboratorios a nivel mundial. Su fundamento es básico y se basa en los RIA, a los cuáles quiso mejorar. Existía una gran preocupación por el uso de material radioactivo, tales como la gestión de residuos y el peligro de exposición del personal, por lo que surgió la idea de aplicar las técnicas de unión de moléculas enzimáticas a anticuerpos desarrollados para técnicas de histoquímica, con el mismo principio de los radioinmunoensayos para análisis serológico.

Básicamente, el ELISA consiste en un anticuerpo o un antígeno unido pasivamente por adsorción en una superficie sólida plástica, como por ejemplo el poliestireno, sobre la que se lleva a cabo una reacción líquida en diferentes pasos y sobre la que se van añadiendo capas de antígenos o anticuerpos para revelar si es positivo o negativo el ensayo. Se realizan etapas de lavado mediante un proceso sencillo y se realiza en placas de microtitulación de 96 pocillos. El desarrollo de esta placas, así como el de las pipetas multicanal y los lectores colorimétricos, pudo hacer que se avanzara con esta técnica enormemente al usar pocos volúmenes de reactivo y suero, así como de la posibilidad de realizar numerosos ensayos simultáneamente.

El ELISA se desarrolló al mismo tiempo que los EIA (ensayos de inmunoenzimáticos), aunque de forma independiente de éstos por los investigadores Peter Perlmann y Eva Engvall de la Universidad de Estocolmo (Suiza), mientras que los EIA fueron desarrollados por el grupo de Anton Schuurs y Bauke van Weemen de los laboratorios NV Organon (Holanda) sobre finales de la década de los 60 y principios de los 70 del siglo XX. De hecho, en 1970 se tuvo la primera curva de calibración de ELISA.  Aunque el principio no fue fácil y numerosos artículos fueron rechazados para publicación en el inicio, alegando que no aportaba nada nuevo. Finalmente, en 1971 Perlmann y Engvall publicaron el primer artículo donde demostraban la determinación cuantitativa de IgG de conejo en suero con fosfatasa alcalina como molécula reveladora de color, y en ese mismo año, Schuurs and Weemen publicaron un trabajo basado en ensayos de EIA donde cuantificaban la hormona gonadotropina coriónica humana (hCG) en orina, con glutaraldehído como molécula reveladora. Hoy día, es una técnica usada ampliamente para serología humana o animal, detección de alérgenos, biotoxinas, antibióticos en alimentos, marcadores tumorales y otras muchas aplicaciones.

La aparición y desarrollo de anticuerpos monoclonales también contribuyó a la mejora y desarrollo de numerosos ELISA, sobre todo para la detección de antígenos en su formato sándwich.

Aplicando los principios de la técnica se desarrollaron diversos tipos de esquema de ensayo, existiendo ELISA directo e indirecto, tipo sándwich o competitivo, cuyos principios se presentan a continuación:

Esquema básico de tipos de ELISA (*Imagen con fines educativos exclusivamente).
  • ELISA directo:
  • Directo con antígeno (Ag) unido a la fase sólida: sobre una antígeno adsorbido pasivamente sobre una fase sólida, y tras un paso de lavado, un anticuerpo (Ab) unido a una enzima se adiciona, y posteriormente, tras el lavado, se añade un sustrato para desarrollar el color que revela la señal positiva.

La limitación de este tipo de ELISA directo es el uso de Ag procedentes de muestras sin mucho procesamiento, debido a la posible unión del Ab marcado con la enzima a Ag no deseados o específicos. También en estos sistemas puede haber menor unión del Ag al plástico por la competición con contaminantes que lo acompañen.

Este ensayo se elige normalmente para la titulación estimada de conjugados de antiespecies unidos a enzimas.

  • Directo con anticuerpo (Ab) unido a la fase sólida: en este modo, se adsorbe pasivamente un Ab al pocillo, y tras un lavado, se adiciona un Ag unido a una enzima. Posteriormente, tras el lavado, se añade un sustrato para desarrollar el color que revela la señal positiva.

Realmente, este modo es poco útil para diagnóstico porque los Ag no se unen con eficiencia. Para ello se modificó haciendo un método competitivo, con mejores resultados.

  • ELISA indirecto:
  • Indirecto con antígeno (Ag) unido a la fase sólida: sobre un Ag adsorbido pasivamente sobre un pocillo, y tras un lavado, se adiciona un Ab (muestra) seguido de un paso de lavado. Posteriormente, se adiciona un anti-Ab marcado con enzima, seguido de un nuevo paso de lavado. Finalmente, se añade al pocillo un sustrato para desarrollar el color que revela la señal positiva.

Este modo es ampliamente usado para el análisis serológico de muestras clínicas. La especificidad del ensayo se relaciona con el antígeno unido a la placa y su nivel de pureza.

  • ELISA tipo sándwich:
  • Sándwich directo: sobre un pocillo se adsorbe pasivamente un Ab. Tras un lavado, se adiciona un Ag (muestra) y se realiza un nuevo paso de lavado. Se añade un Ab marcado con enzima y se realiza un nuevo paso de lavado. Por último, se añade al pocillo un sustrato para desarrollar el color que revela la señal positiva.

El anticuerpo marcado con la enzima puede ser el mismo que está adsorbido en el pocillo, de la misma especie pero distinto Ab o de distinta especie. Además debe ser específico para capturar al Ag diana.

La principal desventaja que presenta es que, como en el ELISA directo, todo el antisuero tiene que estar conjugado. Su uso está indicado principalmente cuando los antígenos a detectar tienen bajo peso molecular o tienen bajo potencial antigénico, por ejemplo.

  • Sándwich indirecto: sobre un pocillo se adsorbe pasivamente un Ab. Tras un lavado, se adiciona un Ag (muestra) y se realiza un nuevo paso de lavado. La modificación respecto al directo consiste en que se añade en este paso un nuevo Ab de distinta especie del Ab unido al pocillo, y tras un nuevo lavado, se añade un Ab marcado con enzima y se realiza un nuevo paso de lavado. Por último, se añade al pocillo un sustrato para desarrollar el color que revela la señal positiva.

La principal ventaja es que esta estrategia evita la reactividad cruzada con la especie adsorbida en el pocillo y permite titular con un solo conjugado para varias especies (en pocillo).

  • ELISA competitivo y de inhibición: consiste en la existencia de un sitio de unión para dos moléculas distintas que compiten entre sí por unirse a este sitio. Los ensayos de competición apropiados deberían añadir los dos analitos al mismo tiempo, pero hay diversas estrategias. El ensayo de inhibición es simular al competitivo, pero en este caso uno de los analitos se añade una vez se ha incubado el primero
  • Competitivo directo:
  • Competición directa por Ab: un Ag se adsorbe pasivamente a un pocillo y se realiza un paso de lavado. Se adiciona a continuación un Ab que compite (sin marcar) en titulación (diferentes concentraciones). Opcionalmente, se puede aplicar un nuevo paso de lavado. Se adiciona a continuación el otro Ab que compite marcado enzimáticamente (pretitulado) y se realiza un nuevo paso de lavado. Por último, se añade al pocillo un sustrato para desarrollar el color que revela la señal positiva. Si el Ab marcado se añade al mismo tiempo que la muestra se trataría de un ensayo competitivo, pero si se hace antes, sería de inhibición o bloqueo.

Estos ensayos son útiles sobre todo para uso con Ab monoclonales.

  • Competición directa por Ag: un Ag se adsorbe pasivamente al pocillo y se realiza un proceso de lavado. A continuación se realiza una incubación simultánea del Ag libre y el Ab marcado enzimáticamente pretitulado que se dirige directamente al Ag adsorbido en la placa. Se ejecuta un paso de lavado a continuación y finalmente, se añade al pocillo un sustrato para desarrollar el color que revela la señal positiva.

Estos ensayos son útiles para cuantificar Ag o comparar la afinidad relativa de unión de dos Ag por la misma muestra de suero.

  • Competitivo indirecto:
  • Competición indirecta por Ab: consiste en esencia en un ELISA indirecto, pero el Ab que compite se añade a la fase sólida con el Ag antes o simultáneamente que el Ab pretitulado específico. La configuración del ensayo supone la adsorción pasiva del Ag y un posterior lavado, para añadir un Ab secundario a varias diluciones, y opcionalmente, realizar a continuación un nuevo paso de lavado. Tras esta etapa, se añade el Ab pretitulado (suero) y se lava. Se añade un conjugado anti-especie frente al Ab pretitulado (suero), y tras un nuevo paso de lavado, finalmente se añade al pocillo un sustrato para desarrollar el color que revela la señal positiva. Se suele usar un 70% de Ab sobre el Ag adsorbido.
  • Competición indirecta por Ag: el esquema del ensayo consiste en la adsorción de un Ag pasivamente a un pocillo y la realización de un paso de lavado. A continuación se lleva a cabo la incubación simultánea del Ag libre (de la muestra) y el Ab anti Ag adsorbido pasivamente en e pocillo en varias diluciones. Tras un nuevo paso de lavado, se adiciona el Ab marcado con enzima anti Ab específico frente al Ag adsorbido añadido en el paso anterior. Se lava y se añade al pocillo un sustrato para desarrollar el color que revela la señal positiva. El Ab pretitulado debe suponer un 70% de la reacción máxima (Ag de la fase sólida en exceso). En este caso se puede decir que se asemeja a un ELISA indirecto donde el Ab es pretitulado frente al Ag de la fase sólida.

Por su versatilidad y facilidad, el número de investigaciones clínicas y analíticas que lo usan es elevado a nivel mundial. La elección de uno u otro tipo de ensayo dependerá del objetivo del mismo, los reactivos disponibles, si es escalable a otros niveles o laboratorios, o qué se hace habitualmente para el mismo tipo de análisis, por ejemplo. E independientemente de estas cuestiones, siempre dependerá de si el ensayo es reproducible, los reactivos son estables en el tiempo o la precisión del ensayo y como de reproducible y robusto sería una vez transferido a otros laboratorios y operadores.

References

  1. Lequin, R. M. Enzyme Immunoassay (EIA)/Enzyme-Linked immunosorbent Assay (ELISA). Clinical Chemistry, Volume 51, Issue 12, 1 December 2005, Pages 2415–2418 https://doi.org/10.1373/clinchem.2005.051532
  2. Engvall, E. The ELISA, Enzyme-Linked Immunososrbent Assay. Clinical Chemistry, Volume 56, Issue 2, 1 February 2010, Pages 319–320. https://doi.org/10.1373/clinchem.2009.127803
  3. Crowther, J.R. Theory and Practice. Part of the Methods in Molecular Biology, Vol. 42. Humana Press. Pág.35-51.

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