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Test de flujo lateral (LFT)

Desde finales de los 80 del siglo pasado podemos encontrar en el mercado los test de flujo lateral (lateral flow test o LFT), por lo que hemos normalizado su uso tanto en el ámbito profesional como en el doméstico. Su presencia, sobre todo durante la pandemia de COVID-19, nos puede hacer caer en el error de pensar que se trata de una tecnología “sencilla”, cuando en realidad es el producto de muchos años de investigación, y como veremos a continuación, supone el compendio de otros ensayos de diagnóstico que se fueron desarrollando de manera paralela a partir de mediados del siglo XX.

La mayoría de los autores coinciden en que el origen de estos ensayos, también llamados  test rápidos o rapid test, se produce en 1956, donde se comercializó la primera tira reactiva para la detección de glucosa en orina. Ese mismo año se desarrolló un test de aglutinación para el diagnóstico del factor reumatoide que utilizaba partículas coloidales de poliestireno (látex). A finales de los 50 salió al mercado el primer radio inmunoensayo  (RIA) que permitía detectar los niveles de insulina en sangre gracias al uso de un antígeno marcado con un elemento radiactivo. Unos años mas tarde aparecieron los primeros test enzimáticos (EIA) lo que supuso otro gran avance en el campo del diagnóstico.

Desde principios de los 60 hasta el lanzamiento en 1988 del Clearblue 1-step test (embarazo), primer LFT en el mercado, fue un periodo de tiempo donde se optimizaron los procesos de obtención de membranas de celulosa, anticuerpos, materiales (poliéster, fibra de vidrio, etc) así como el diseño y fabricación de toda la maquinaria necesaria para la elaboración de este tipo de productos. Un hecho curioso es que hasta 1973 no se dispuso de un método reproducible de obtención de partículas de oro. Recordamos de un post anterior, que el oro coloidal se usa desde el tiempo de lo romanos, por lo que llama atención que hasta finales del siglo XX no se tuviera una forma de hacerlo de manera controlada. En la actualidad es uno de los soportes coloidales más utilizados en la tecnología del test rápido.

El fundamento de un LFT es el mismo que otros muchos métodos de diagnóstico, como por ejemplo el ELISA, aunque tiene una serie de particularidades que lo hacen diferente. El hecho de que su lectura sea visual, para una única determinación y que no requiera de un aparataje muy complejo, lo hace ideal para uso doméstico, clínicas de pequeño tamaño o para un consultorio médico. No solo se utilizan en diagnostico clínico, si no que los podemos encontrar en campos tan diversos como la enología, agricultura, en el control de calidad de industrias como la cárnica, láctea o de la miel hasta en la determinación de alérgenos en superficies o alimentos.

El esquema de una tira o strip de un rapid test puede ser como el que se presenta en la siguiente figura, donde además de sus componentes se explica gráficamente su funcionamiento.  Veamos a continuación en mas detalle cada uno de estos elementos y su función dentro del strip.

Almohadilla (pad)  de muestra. Como su nombre indica es el lugar donde se añade la muestra, que puede ser sangre, suero/plasma, orina, saliva o otro fluido de interés, lo que dependerá del propósito del test. Su función es la absorber la muestra y ponerla en contacto con el conjugado. Normalmente, tras la adición se añade una solución de empuje, también llamada running buffer o developer. Se emplea para facilitar el flujo de la muestra junto con el conjugado a lo largo de la membrana.

El pad de muestra suele ser una sustancia porosa que deja pasar el líquido con facilidad y que no retiene. Los materiales mas usados habitualmente son papel, poliéster, fibra de vidrio o acetato de celulosa entre otros.

Pad de conjugado.  El conjugado consiste en la mayor parte de los casos en una solución de partículas coloidales unidas a una proteína específica del antígeno o el anticuerpo que se quiere detectar. Si la muestra contiene el analito deseado, se produce la primera reacción inmunológica con el conjugado. Estos complejos son los que gracias al running buffer fluyen por la membrana y dan  respuesta.

Como sucedía con el de muestra,  el material ha de ser poroso con capacidad de contener el conjugado seco pero de “soltarlo”cuando entra en contacto con la muestra y el developer. De nuevo el  poliéster, acetato de celulosa o la fibra de vidrio son las  posibles elecciones para este pad.

Membrana : líneas test y control. La detección se lleva a cabo sobre una membrana porosa, habitualmente hecha de nitrocelulosa (NCM), en la cuál suele haber dosificadas dos líneas, una test o test line y otra control (control line). La primera es donde se quedarán retenidos los complejos conjugado-analito, dando por tanto a la formación de una línea visible, siempre y cuando la concentración de la muestra positiva sea suficiente. La línea control tiene por cometido determinar si el test está funcionando apropiadamente. Suele ser un anticuerpo contra la proteína del conjugado, aunque en algunas ocasiones se suele emplear un par conjugado-línea control diferente al de la línea test.

Pad de absorción. Su función es la de “limpiar” la membrana de los restos de muestra, conjugado y developer. Suele estar hecho de papel de varios mm de grosor.

Soporte plástico o “ backing. Es donde van pegados todos los elementos anteriormente descritos, los tres pads y la membrana y su función es la de dar rigidez a la tira. Está hecho habitualmente de poliestireno.

Casete. La mayoría de los test rápidos vienen dentro de una pieza de plástico compuesta de dos partes, superior e inferior. La de arriba está formada por un pocillo de muestra, una ventana centrada en la membrana y una zona final, sobre el pad de adsorción, donde en muchos casos viene escrito el nombre del producto o contiene un código de barras o QR con la información básica del test. La parte inferior es donde se pone la tira.

Posee internamente una serie de barras de presión que facilita el flujo por la membrana, de forma que el diseño de la tira se hará pensando en dicha disposición. El tamaño y profundidad del pocillo también determina el volumen de muestra o el número de gotas de developer. La longitud y anchura de la tira se definirán en función de las características internas del casete. La posición de las líneas test y control se establecerán igualmente dependiendo de la longitud y posición de la ventana de lectura.

Este sería el diseño más clásico de un LFT, aunque también se puede encontrar en el mercado en formato dipstick, es decir, una tira pero sin casete. Suele emplearse para determinaciones con una gran cantidad de muestra, como es el caso de la orina.

Aunque todos los componentes anteriormente descritos son importantes en el funcionamiento del test, podemos decir que los requieren de un mayor estudio para su diseño y preparación son el conjugado y la membrana (pegado de las líneas). Ambos son los que definen el funcionamiento del producto, ya que el conjugado es que reacciona con la muestra y las líneas son las que seleccionan aquellos complejos que contienen el analito a detectar.

Conjugado. La mayoría de los LFT que hay en el mercado utilizan partículas de oro o de poliestireno. La elección dependerá de factores tales como la naturaleza de la proteína a adsorber, el límite de detección o simplemente a motivos meramente “estéticos”. Mientras que en los coloides de oro el color está limitado a tonalidades entre el naranja y el rojo púrpura, el látex permite tener una amplia gama, que en algunos casos puede ser conveniente para distinguir las líneas en un test multiparamétrico. Otra de las diferencias es el tipo de unión que se puede hacer en cada caso. En el oro la más habitual es la fisisorción (por fuerzas hidrofóbicas), pero en el caso del poliestireno la naturaleza de la superficie puede ser muy diversa, de forma que además de la fisisorción se puede hacer mediante enlace covalente.

En líneas generales el oro es más sencillo de conjugar y más económico, pero adolece de la posibilidad de hacer una unión química o de diferentes tamaños (menos rango que el látex). Otras de las ventajas que tiene el oro coloidal es el hecho de que se puede fabricar en el propio laboratorio. Se trata de un método bastante sencillo, mientras que en el poliestireno requiere de la utilización de sustancias que implican cierto riesgo para la salud y de una maquinaria algo más compleja.

Membrana. Puede ser de diferentes tipos, aunque como ya se comentó con anterioridad, la nitrocelulosa es el más habitual. Dependiendo del material, las fuerzas responsables de la unión de las proteínas son diferentes, de forma que en la NCM son electrostáticas, en el PVDF (fluoruro de polivinilideno) son hidrofóbicas, en el nylon (poliamidas) electrostáticas, etc. En el caso concreto de la nitrocelulosa, la unión entre la proteína y la membrana se debe a la interacción electrostática entre los dipolos éster del nitrato y del péptido de la proteína.

La elección de la membrana se establece en función de los siguientes parámetros: tamaño medio de los poros y distribución de los mismos, capacidad de unir proteínas (interacciones implicadas), la fuerza de tensión y la porosidad. El tamaño es el que determina la cantidad de proteína adsorbida, de forma que será menor cuanto mayor sea el diámetro del poro. La distribución de los poros ha de ser homogénea para que flujo por la membrana sea regular. Puede que la nitrocelulosa no tenga la misma capacidad para unir proteínas, como por ejemplo el nylon que es mucho mayor, pero se sabe que la razón entre la cantidad unida y las reacciones inespecíficas es menor que en otros materiales. En el nylon es posible adsorber mayor número de moléculas lo que normalmente aumenta la posibilidad de encontrar más falsos positivos, que en muchos no son fáciles de eliminar. Finalmente, la porosidad determinará la velocidad de paso por la membrana.

 Tras la pandemia de COVID-19 y la popularización de los LFT, las expectativas para esta técnica son enormes. Por un lado está el hecho de que cada vez se hace mas necesario que los pacientes sean en parte responsables del diagnóstico y control de sus patologías, lo que se conoce con el nombre de autodiagnóstico. La facilidad de uso de los rapid test lo hacen ideal para este cometido, a lo que se unen las nuevas tecnologías. Ahora es posible utilizar el smartphone para realizar las lecturas del test e interpretarlas o compartirlas con nuestro facultativo. Por otro lado está el hecho de que los LFT se pueden combinar con otras técnicas o implementar con nuevos materiales. Por ejemplo, gracias a uso de los microcircuitos (lab on a chip) es posible realizar una PCR isoterma, también denominada Amplificación Isoterma Mediada por Bucle, más conocida como LAMP, y usar los productos obtenidos en un LFT. Sólo es cuestión de tiempo que se convierta en un ensayo doméstico de alta sensibilidad y fácil lectura con muestras nasofaríngeas por ejemplo. Otra de las tendencias actuales es la de emplear muestras no invasivas, como puede ser la orina, saliva o el sudor.

Referencias

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  2. – O’Farrell B. (2008). Evolution in Lateral Flow–Based Immunoassay Systems. Lateral Flow Immunoassay, 1–33. https://doi.org/10.1007/978-1-59745-240-3_1.
  3. .- Frens, G. (1973). Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensions. Nature physical science, 241(105), 20-22.
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  2. – Rapid Lateral FlowTest Strips: considerations for product development (Re. A 07/06 edn). (2006). Millipore Corporation.
  3. – Sun C, Xiao F, Fu J, Huang X, Jia N, Xu Z, Wang Y, Cui X. Loop-Mediated Isothermal Amplification Coupled With Nanoparticle-Based Lateral Biosensor for Rapid, Sensitive, and Specific Detection ofBordetella pertussis. Front Bioeng Biotechnol. 2022 Feb 8;9:797957. doi: 10.3389/fbioe.2021.797957. PMID: 35211469; PMCID: PMC8861531.

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