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REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

By DIVULGO|diagnóstico  15 Noviembre 2022

Las siglas PCR son el acrónimo de Polymerase Chain Reaction, o lo que es lo mismo, Reacción en Cadena de la Polimerasa. Fue descubierta por el doctor Kary Banks Mullis (1944-2019) en 1983, hecho por el cual recibió el Premio Nobel de química en 1993. Se trata de una técnica destinada a la detección de material genético en una determinada muestra y su mayor ventaja radica en que a partir de una mínima cantidad de ácido nucleico, ADN o ARN, es posible obtener una gran cantidad del mismo. Aunque las principales aplicaciones de la PCR son en el campo del diagnóstico clínico, sus usos crecen cada día más en disciplinas tan variadas como la genética, criminología, palentolgía o clonación entre otras.

Desde su descubrimiento hasta nuestros días la PCR ha cambiado enormemente, en aspectos tan importantes como la reproducibilidad, sensibilidad, velocidad, automatización y demás. En la actualidad no existe una única forma de hacerlo, si no se pueden encontrar diferentes métodos, como inversa, anidado, cuantitativa (Q-PCR), de transcripción inversa (RT-PCR), etc. En el presente post queremos mostrar los conceptos básicos de una PCR y dejar para más adelante uno donde se muestren sus diferentes variantes y aplicaciones.

Básicamente los componentes de una PCR de ADN (la más común) son los siguientes:

  • Cebadores o primers. Su función es la de delimitar en la hebra simple de ADN la zona que se tiene interés en copiar. Se tratan de fragmentos cortos de una longitud de unos 10 pares de bases. Como se puede ver en la imagen, los cebadores se unen al extremo 3’ de cada una de las cadenas dejando el resto para que se completen con los los nucleótidos.
  • Nucleótidos. Se podría decir que son los “ladrillos” con los que se construyen las cadenas de ácido nucleico. Como sabemos hay 4, adenina (A), citosina (C), guanina (G) y timina (T), y se componen de una base nitrogenada, pentosa (un azucar) y una molécula de ácido fosfórico. El siguiente componente, la ADN polimerasa,es la que se encarga de colocar los nucleotidos en su posiciones complementarias.
  • ADN polimerasa. Se trata de una enzima capaz de generar una cadena de ácido nucleico a partir de un ADN molde. La más utilizada es la Taq polimerasa, que recibe su nombre de la bacteria que la produce, la Thermus Aquaticus. A diferencia de otras, como por ejemplo la proveniente de E.Coli, puede trabajar a altas temperaturas sin desnaturalizarse, algo necesario en todo proceso de PCR como veremos más adelante. Las ADN polimerasas requieren de cationes divalentes para funcionar de forma correcta, y normalmente se emplea manganeso.
  • Termociclador. Es uno de los elementos fundamentales de toda PCR. Se trata de un instrumento donde se llevan a cabo los ciclos de temperatura necesarios para realizar el proceso como veremos a continuación.

Estos serían los componente esenciales de toda PCR. Aunque parezca sencillo, detrás existe un gran trabajo de diseño, donde primero hay que determinar que zona del ácido nucleico se quiere replicar. A partir de aquí se construyen los cebadores y se determinan las cantidades de los diferentes elementos, así como la temperatura, los tiempos y el número de ciclos necesarios.

Una vez que se encuentran juntos todos los componentes en el tubo de reacción (ver figura), a la hora de promover la duplicación del ácido nucleico, la primera fase sería desnaturalizarlo (separación de las hebras), lo que permite la unión de los cebadores con su región complementaria. Seguidamente actuará la polimerasa “rellenando los huecos” con los nucleótidos y generando una nueva cadena de ácido nucleico. La PCR por tanto consiste en la repetición de estas tres reacciones de manera cíclica: desnaturalización, hibridación y extensión. El número de ciclos suele ser entre 20 y 35.

Polymerase Chain Reaction (PCR)

  • Desnaturalización. Suele durar unos 30 segundos donde la temperatura es de aproximadamente 90-96ºC. La cadena de ADN se separa en dos hebras sencillas.
  • Hibridación o annealing. Los cebadores se unen a sus zonas correspondientes, delimitando la parte de ácido nucleico que se va a replicar. La temperatura a la que se realiza esta fase suele ser variable (depende de cada caso concreto) y de media ronda los 60-70ºC y el tiempo habitual son 30 segundos.
  • Polimerización o elongación. La ADN polimerasa completa las cadenas con los nucleótidos complementarios. Como indica la figura la temperatura suele ser 72ºC y el tiempo 45 segundos.

Por tanto, en el primer ciclo completo el fragmento de ADN escogido se habrá duplicado, de manera que tras 35 ciclos lo habrá hecho 235, es decir, se tendrán 34000 millones de copias del ADN original.

En futuros post mostraremos en más detalle todos los tipos de PCR, sus aplicaciones y también todo el proceso histórico que llevó al descubrimiento de esta técnica tan revolucionaria.

Referencias

  1. Mahanama A, Wilson-Davies E. Insight into PCR testing for surgeons. Surgery (Oxf). 2021 Nov;39(11):759-768. doi: 10.1016/j.mpsur.2021.09.016. Epub 2021 Oct 25. PMID: 34720325; PMCID: PMC8545672.
  2. Faster PCR with Platinum II Taq DNA Polymerase. (s. f.-c). https://www.thermofisher.com/nl/en/home/life-science/cloning/cloning-learning-center/invitrogen-school-of-molecular-biology/pcr-education/pcr-reagents-enzymes/pcr-basics.html
  3. PCR: Reacción en cadena de la polimerasa [TEÓRICO Y PRÁCTICO]. (2021, 21 junio). [Vídeo]. YouTube. https://www.youtube.com/watch?v=mpRy8CSAISs

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